His (полигистидин) - меченые белки

Метод металло-хелатной хроматографии (IMAC - immobilized metal affinity chromatography) наиболее часто используется для очищения Полигистидин- (His-) меченых белков. Эта технология основывается на взаимодействии между некоторыми открытыми белковыми остатками (преимущественно гистидины) с катионами переходных металлов (Cu²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, Co²⁺). Промежуточный металл сам по себе иммобилизован на агарозном матриксе с помощью хелатной группы - такой как иминодиуксусная кислота (IDA)^[1] или нитрилотриуксусная кислота(NTA).

Успешность очистки His-меченых белков сильно зависит от конкретной последовательности аминокислот, конформации белка и микросреды, локализации His-метки (C- или N-конец). Кроме того, часто наблюдается нежелательная соочистка неспецефических белков клетки-хозяина, особенно в случае системы экспрессии E. coli.

Альтернативные стратегии применения обычного раствора - например, увеличение солености, концентрации детергента, варьироване локализации His-метки, оптимизация стратегии очистки может быть легко достигнута через:

• варьирование плотности металлических ионов, поскольку меньшее их количество может минимизировать неспецифическое связывание белка.^[2-4].
• замена ионов на другой металл^[2,3].

Основываясь на принципе ЖМКО Пирсона (HSAB concept), связанные IDA (иминодиацетатом) ионы Cu²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ проявляют разное сродство и специфичность к гистидинам^[2,3]. Тогда как ионы Ni²⁺ проявляют высокое сродство, но низкую специфичность, ионы Co²⁺ более специфичны, но с уменьшенной связывающей способностью и, следовательно, возможностью уменьшить неспецифичное связывание белков.

Магнитные агарозные гранулы Ni-NTA (никель -нитрилоацетат) и Co-NTA (кобальт -нитрилоацетат)

Ферромагнитные агарозные гранулы, пригодные для быстрого и эффективного маломасштабного очищения полигистидин(His-) меченых белков.

Магнитные агарозные гранулы Ni-IDA (никель -иминодиацетат) и Co-IDA (кобальт -иминодиацетат)

Ферромагнитные агарозные гранулы, пригодные для быстрого и эффективного маломасштабного очищения полигистидин(His-) меченых белков.

Агароза Ni-NTA (никель -нитрилоацетат)

6 % cross-linked agarose suitable for FPLC, gravity flow and batch purification by a one-step procedure from crude lysates both under denaturing and non-denaturing conditions

Агароза Ni-IDA (никель - иминодиацетат)

High-performance 6 % cross-linked agarose suitable for FPLC, gravity flow and batch purification of polyhistidine tagged proteins.

Агароза IDA для гравитационных колонок: безметаллическая, содержащая никель, цинк, кобальт, медь

6 % поперечно-связанная агароза применима для тонкой настройки стратегии очистки через гибкий выбор иона металла и плотности загрузки ионов. Эта агароза рекомендована только для гравитационной хроматографии.


Избранные ссылки:

[1] Porath et al. (1975) Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258:598.

[2] Gaberc-Porekar et al. (2001) Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography. J. Biochem. Biophys. Methods 49:335.

[3] Ueda et al. (2003) Current and prospective applications of metal ion–protein binding. Journal of Chromatography 988:1.

[4] Liesiene et al. (1997) Immobilized metal affinity chromatography of human growth hormone-effect of ligand density. Journal of Chromatography 764:27.