Анализ динамики поли(А)-хвоста (полиаденилирование)

Поли(А) хвосты, длинные цепы аденозиновых нуклеотидов различной длины, посттранскрипционно добавляются к 3'-концу эукариотических мРНК поли(А) полимеразой (полиаденилирование). Эта модификация играет важную роль в метаболизме мРНК и, таким образом, регуляции генов, например, путем влияния на стабильность мРНК, ядерный экспорт и эффективность трансляции ^[1].

Традиционный метод анализа поли(А) хвостов не позволяет различать уже существующие и вновь полиаденилированные мРНК транскрипты, например, индуцированные изменениями в сигнальных путях.

Тва КЛИК-функционализированных аналога аденозина - N⁶-Пропаргил-Аденозин (N⁶pA)^[2] и 2-Этинил-Аденозин (2-EA)^[3] могут быть подходящим решением для мониторинга полиаденилирования в клетках млекопитающих. N⁶pA и 2-EA - являются клеточно-проницаемыми и способны встраиваться вместо их натуральных аналогов как при транскрипции РНК полимеразами I, II и III, так и пост-транскрипционно поли(А) полимеразой (Figure 1A). In vitro полиаденилирование может быть выполнено с использованием АТФ аналогов N⁶-Пропаргил-ATP (N⁶pATP)or 2-Этинил-ATP (2-EATP) , которые служат субстратом для поли(А) полимеразы из клеточного экстракта^[2] (Figure 1B).

Figure 1: A) Принцип in vivo полиаденилирования с клеточно-проникающими этинил-функционализированными аналогами 2-EA или N6pA ^[3], соответственно. B) Принцип in vitro полиаденилирования с этинил-функционализированными АТФ аналогами 2-EATP ^[2] или N6pATP ^[3], соответственно. Итоговая этинил-функционализированная РНК может быть впоследствии помечена в Cu(I)-катализируемой клик-реакции, позволяющей включение Биотиновой группы или флуоресцентного красителя. (Азиды Биотина) (флуоресцентные Азиды).

РНК