Дидеоксинуклеотиды (ddNTP)

У дидеоксинуклеотид трифосфатов (ddNTP) отсутствует 3'-OH группа, которая необходима для удлинения цепи посредством полимеразы в ПЦР. Таким образом, ddNTP используются в сочетании с модифицированной Taq-полимеразой (например, JBS сиквенсовой полимеразой или Thermosequenase™) как 3'-концевые терминаторы в секвенировании по Сенгеру^[1] (Fig. 1) генотипировании однонуклеотидного полиморфизма (SNP) по элонгации праймера (SBE)^[2] (Fig. 2). Степень очистки ddNTP составляет > 98 % (ВЭЖХ), они функционально испытаны для терминации цепи при сиквенсе.

Figure 1: Ферментативный метод секвенирования Сэнгера с дидеокси- обрывом цепи ^[1] основан на линейной амплификации одноцепочечной матричной ДНК с использованием 5'-флуоресцентно меченого праймера и модифицированной Taq полимеразы. Синтез комплементарной ДНК-цепи начинается на специфическом праймер-сайте и заканчивается включением обрывающего цепочку ddNTP, который случайным образом введен вместо соответсвующего dNTP. При использовании четырех разных ddNTP в четырех отдельных реакционных пробирках, получается набор цепей удлиненных праймеров, терминированных в каждой позиции A, C, G и T. Когда эти фрагменты разделены на подходящей гелевой матрице, последовательность ДНК определяется по порядку смещения полос (снизу вверх).

Вы также можете ознакомиться с нашими Наборами для секвенирования

Figure 2: Одиночное удлинение праймера(SBE) - надежный метод для детекции однонуклеотидного полиморфизма в a priori известной позиции^[2]. Он основан на удлинении праймера, подобранного чтобы связываться на один нуклеотид раньше полиморфного, соответствующим ddNTP. Последующая детекция встроенных ddNTP проводится с помощью масс-спектрометрии удлиненных праймеров is performed by mass spectrometry of the extended primer, таким образом выявляя нуклеотидное основание в этой позиции на матричной цепи.^[3].

Секвенирование ДНК (метод Сэнгера)