Клеточный цикл и пролиферация

Пролиферация клеток характеризуется de novo синтезом ДНК в течение S-фазы клеточного цикла в соответствии с увеличением транскрипционной активности, сопровождаемой de novo синтезом РНК.

Обычный подход к мониторингу общего синтеза ДНК и РНК основан на включении аналога 5-меченого (деокси) уридина вместо его структурного аналога (в РНК - урацила, в ДНК тимидина) в синтезируемую ДНК или РНК цепь клеточной ДНК или РНК полимеразой соответственно. Нефосфорилированный меченый (деокси)уридин (5-X-(d)U) является клеточно-проницаемым и потому пригоден для in vivo мечения (в живых клетках)^[1-5]. Напротив, меченые (деокси)уридин трифосфаты (5-X-(d)UTP) не являются клеточно-проницаемыми и могут быть использованы для in vitro анализа синтеза ДНК/РНК (в бесклеточных экстрактах)^[6,7], или необходимо доставлять их в клетки для in vivo исследований, например, в липосомах (липофекция) или микроинъекциями^[8].

Традиционные подходы основаны на включении Бромин-меченых (деокси)уридинов (5-Br(d)U) или (деокси)уридин-трифосфатов (5-Br(d)UTP), которые затем детектируются специфическими антителами BrdU (Таб. 1). Однако, существуют жесткие процедуры обеспечения проницаемости, необходимые для достижения достаточной эффективности окрашивания, необходимые вследствие высокой молекулярной массы антител (около 150.000 kDa), что ограничивает уровень диффузии антител в клетку.

Внедрение этинил-меченого (деокси) уридина (5-E(d)U) обеспечивает новую альтернативу мониторингу синтеза ДНК и РНК in vivo. Детекция 5-E(d)U достигается ковалетной конъюгацией с азид-содержащим флуорофором в Cu(I) катализируемой алкин-азид клик-реакции (CuAAC) (Таб. 1), которые легко вводить в клетки в мягких условиях проницаемости вследствие их значительно меньшего размера (<1000 kDa).

Измерение de novo...	Проникающие в клетку нуклеотиды	Не проникающие в клетку нуклеотиды	Детекция
...ДНК синтеза	5-BrdU[1]	5-BrdUTP[2]	BrdU специфические антитела
	5-EdU[3,4]		Азиды флуоресцентных красителей
...РНК синтеза	5-BrU[5]	5-BrUTP[6,7]	BrdU специфические антитела
	5-EU[8]		Азиды флуоресцентных красителей

Также доступны другие алкин-модифицированные аналоги уридина - такие, как 5-EdUTP или EUTP

[1] Vogel et al. (1986) Detection of bromodeoxyuridine-incorporation in mammalian chromosomes by a bromodeoxyuridine-antibody. Human Genetics 72(2):129.
[2] Salic et al. (2008) A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:2415.
[3] Li et al. (2010) Fluorogenic "click" reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques 49(1):525.
[4] Halicka et al. (2010) Segregation of RNA and separate packaging of DNA and RNA in apoptotic bodies during apoptosis. Exp. Cell Res. 269:248.
[5] Jao et al. (2008) Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(41):15779.
[6] Pasero et al. (1999) In vitro DNA replication in yeast nuclear extracts. Methods 18(3):368.
[7] Javed et al. (2004) In situ immunofluorescence analysis analyzing RNA synthesis by 5-Bromouridine-5’-Triphosphate labeling. Methods in Molecular Biology 285(1):29.
[8] Haukenes et al. (1997) Labeling of RNA transcripts of eukaryotic cells in culture with BrUTP using a liposome transfection reagent (DOTAP). Biotechniques 22:308.

1 Unit = 1 µl of a 10 mM раствора.

Клеточная биология