Апоптоз (TUNEL assay) Nucleotides by Application / ... in Cell Biology - Apoptosis (TUNEL assay)
|
 |
Апоптоз - это внутриклеточная смертельная программа, ведущая к характерным биохимическим и морфологическим изменениям в клетке, приводящим к ее смерти[1]. Неспособность клеток к апоптозу - частый признак многих видов рака[2], поэтому изучение индуцирующих механизмов имеет особое значение для исследований рака и требует соответствующих методов детекции.
Отличительной чертой позднего апоптоза является обширная фрагментация геномной ДНК, которая создает множество двунитевых разрывов ДНК (DSBs) с доступной 3'-гидроксил (3'-OH) группой. Эта черта дает основу для общепризнанного метода детекции апоптоза: ник - концевое мечение dUTP при помощи терминальной деоксинуклеотидил трансферазы (TdT) (TdT dUTP Nick End Labeling - TUNEL) анализ[3].
TUNEL анализ идентифицирует апоптозные клетки с помощью терминальной деоксинуклеотидил трансфераза (TdT)-опосредованного добавления меченых (X) деоксиуридин трифосфат нуклеотидов (X-dUTP) к 3’-OH концу разрыва ДНК цепи, что затем визуализируется способом, соответствующим внедренной метке (Рис. 1), таким образом служа показателем процентного соотношения апоптозных клеток в анализируемой клеточной популяции.
Чувствительность анализа сильно зависит от эффективности внедрения модицицированных dUTP, что зависит от размера/громоздкости прикрепленной метки. Ряд флуоресцентно меченых dUTP, биотинилированных dUTP или дигоксигенилированных dUTP в целом пригодны в качестве субстрата для TdT, но dUTP с меньшими метками такими, как бромин (BrdUTP) или алкиновая группа (EdUTP) демонстрируют более высокую эффективность внедрения и, следовательно, более высокую чувствительность в TUNEL анализе, вероятно, из-за минимальных пространственных затруднений[3,4,5].
Внедрение BrdUTP определяется по специфическому флюорофору или репортерному белку, меченому антителами (Рис. 1A), определение EdUTP достигается ковалентной конъюгацией азид-содержащего флюорофора в Cu(I)-катализируемой алкин-азидной клик-реакции (CuAAC) (Рис. 1B).
Отличительной чертой позднего апоптоза является обширная фрагментация геномной ДНК, которая создает множество двунитевых разрывов ДНК (DSBs) с доступной 3'-гидроксил (3'-OH) группой. Эта черта дает основу для общепризнанного метода детекции апоптоза: ник - концевое мечение dUTP при помощи терминальной деоксинуклеотидил трансферазы (TdT) (TdT dUTP Nick End Labeling - TUNEL) анализ[3].
TUNEL анализ идентифицирует апоптозные клетки с помощью терминальной деоксинуклеотидил трансфераза (TdT)-опосредованного добавления меченых (X) деоксиуридин трифосфат нуклеотидов (X-dUTP) к 3’-OH концу разрыва ДНК цепи, что затем визуализируется способом, соответствующим внедренной метке (Рис. 1), таким образом служа показателем процентного соотношения апоптозных клеток в анализируемой клеточной популяции.
Чувствительность анализа сильно зависит от эффективности внедрения модицицированных dUTP, что зависит от размера/громоздкости прикрепленной метки. Ряд флуоресцентно меченых dUTP, биотинилированных dUTP или дигоксигенилированных dUTP в целом пригодны в качестве субстрата для TdT, но dUTP с меньшими метками такими, как бромин (BrdUTP) или алкиновая группа (EdUTP) демонстрируют более высокую эффективность внедрения и, следовательно, более высокую чувствительность в TUNEL анализе, вероятно, из-за минимальных пространственных затруднений[3,4,5].
Внедрение BrdUTP определяется по специфическому флюорофору или репортерному белку, меченому антителами (Рис. 1A), определение EdUTP достигается ковалентной конъюгацией азид-содержащего флюорофора в Cu(I)-катализируемой алкин-азидной клик-реакции (CuAAC) (Рис. 1B).
Рисунок 1: Принцип TUNEL анализа основана на TdT-катализируемом присоединении модифицированного dUTP (X-dUTP) к 3’-OH концу ДНК фрагмента, генерируемого в результате индукции апоптоза. Чтобы избежать потери фрагментированной ДНК и обеспечить проникновение фермента и нуклеотида, клетка должна быть зафиксирована и перед реакцией мечения необходимо обеспечить проницаемость клеточной мембраны.
Внедрение бромилированной dUTP (BrdUTP) определяется специфическими конъюгатами антител и репортерных белков или флуоресцентных красителей(A).
Внедрение алкин-содержащих dUTP (EdUTP) визуализируется в Cu(I)-катализируемой алкин-азидной клик-реакции (CuAAC) с азид-содержащим флуорофором (B).
Внедрение бромилированной dUTP (BrdUTP) определяется специфическими конъюгатами антител и репортерных белков или флуоресцентных красителей(A).
Внедрение алкин-содержащих dUTP (EdUTP) визуализируется в Cu(I)-катализируемой алкин-азидной клик-реакции (CuAAC) с азид-содержащим флуорофором (B).
| |||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||
Datasheet
| ||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||
Информация представлена исключительно в ознакомительных целях и ни при каких условиях не является публичной офертой
