qPCR Probes Core Kit

+7(499)397-01-09 Корзина

Каталог > Реактивы > Методы > ПЦР > ПЦР в реальном времени > Основные наборы для количественной ПЦР >
qPCR Probes Core Kit Набор для количественной ПЦР в реальном времени с использованием меченых ДНК-зондов

Хранить при -20°C
Избегать повторного замораживания/размораживания
Срок годности: 12 месяцев

Набор PP-331 предназначен для количественного real-time анализа образцов ДНК с детекцией на основе ДНК-зондов. Набор рекомендован для использования с флуоресцентными зондами с двойной меткой, например TaqMan®, молекулярными маяками или FRET-зондами. Он предоставляет мощный инструмент для количественной оценки образцов ДНК в широком динамическом диапазоне с исключительной чувствительностью и точностью.
Высокая специфичность и чувствительность набора достигается при помощи оптимизированной полимеразы горячего старта. Ее активность блокируется при умеренной температуре и автоматически включается при старте начальной денатурации. Температураня активация предотвращает элонгацию неспецифически отжигающихся праймеров и праймер-димеров при низких температурах в процессе подготовки ПЦР. Поставляемая в комплекте смесь нуклеотидов содержит dUTP вместо dTTP и позволяет проводить обработку UNG (Урацил-N-Гликозилазой) в начале термоциклирования для предотвращения контаминации переносимой из предыдущих реакций ДНК.
Реагенты набора оптимизированы для использования в блочных ПЦР-инструментах. Набор также может использоваться с ROX референсным красителем в ПЦР-инструментах, совместимых с оценкой ROX сигнала. В этом случае, краситель ROX должен добавляться к ПЦР реакции в 1х концентрации.

Название

Код

Цена

Количество

L pack

PCR-331L

по запросу

500 reactions x 50 µl

S pack

PCR-331S

по запросу

100 reactions x 50 µl

Документы
Datasheet

В набор входит

	PCR-331S (100 реакций)	PCR-331L (500 реакций)
qPCR Pol, 5 ед./µl (красная крышка)	30 µl	130 µl
Смесь dNTP (вкл. dUTP) 10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 20 mM dUTP (белая крышка)	120 µl	600 µl
qPCR-буфер готовый, 10х конц. 200 mM Tris-HCl (pH 8.5), KCl, (NH₄)₂SO₄ , 30 mM MgCl₂ и стабилизаторы (зеленая крышка)	1 ml	3 * 1 ml
qPCR-буфер без MgCl₂, 10х конц. 200 mM Tris-HCl (pH 8.5), KCl, (NH₄)₂SO₄ и стабилизаторы (синяя крышка)	1 ml	3 * 1 ml
MgCl₂, стоковый раствор 25 mM MgCl₂ (желтая крышка)	1.2 ml	5 * 1.2 ml

ДНК-зонды с двойной меткой

Технология ПЦР в реальном времени, основанная на ДНК-зондах с двойной меткой, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность ПЦР-систем, в том числе мультиплексных (многолокусных). Для этого требуется два стандартных ПЦР-праймера и ДНК-зонд, который гибридизуется к внутренней части ампликона. Последовательность ДНК-зонда с двойной меткой подбирается таким образом, чтобы избегать формирования вторичной структуры и праймер-димерных образований.

Подготовка мастермикса для qPCR

Подготовка мастермикса - ключевой этап в количественной ПЦР для уменьшения ошибок дозирования. Подготовьте мастермикс всех компонентов кроме матрицы, как указано ниже. Рекомендованный для большинства инструментов объем реакции - 20-50 µl. Подготовьте 13 объемов мастермикса для 12 образцов или тройного комплекта из 4 образцов. Дозируйте наконечниками со стерильными фильтрами и минимизируйте пребывание меченых ДНК-зондов на свету. Желательно производить подготовку в зоне, отдельной от зон подготовки ДНК и анализа. Отрицательный котроль должен быть включен во все амплификации.

	1 х 50 µl	13 х 50 µl	Итоговая концентраци
qPCR-буфер готовый	5 µl	65 µl	1х
Смесь dNTP	1 µl	13 µl	200 µM
Прямой праймер (10 µM)¹	1.5 µl	19.5 µl	300 nM
Обратный праймер (10 µM)¹	1.5 µl	19.5 µl	300 nM
Проба с двойной меткой (10 µM)²	1 µl	13 µl	200 nM
UNG (PCR-353)³	0.2 µl	2.6 µl	0.2 ед./пробу
qPCR Pol ³	0.25 µl	3.25 µl	0.025 ед./µl
Вода для ПЦР	Долить до 40 µl	Долить до 520 µl	-

1) Оптимальная концентрация каждого праймера может варьировать от 100 до 500 nM.
2) Оптимальные результаты могут требовать титрования концентрации ДНК зондов между 50 и 800 nM.
3) Требуется только если требуется обработка UNG (Урацил-N-Гликозилазой) для предотвращения переносимой контаминации ДНК. UNG не поставляется в данном наборе.

Оптимизация концентрации MgCl₂

Рекомендуемая для большинства приложений концентрация Mg2+ 3.0 mM имеется в 10х готовом qPCR буфере (зеленая крышка). Для индивидуальной оптимизации используйте реакционный буфер без MgCl₂ и добавляйте стоковый раствор MgCl₂ как указано в таблице ниже.

MgCl₂ стоковый раствор	4 µl	6 µl	8 µl	12 µl
Итоговая концентрация MgCl₂	2 mM	3 mM	4 mM	6 mM

Дозирование мастермикса:

Тщательно перемешайте мастермикс на вортексе для достижения гомогенности. Перенесите по 40 µl в ПЦР пробирки или лунки ПЦР-планшета.

Добавление ДНК-матрицы:

Добавьте 10 µl препарата ДНК-матрицы к каждой реакционной емкости, содержащей 40 µl мастермикса и закройте или запечатайте пробирку/планшет. Не добавляйте более 500 ng ДНК на 50 µl реакции в итоговой концентрации. Пробирки или планшеты должны быть центрифугированы перед термоциклированием для удаление возможных пузырьков.