1. Каталог >
  2. Реактивы >
  3. Объекты >
  4. РНК >
  5. Выделение РНК из биологического материала >
  6. Выделение и очистка РНК >

Набор для выделения тотальной РНК

Выделение тотальной РНК адсорбцией на силикагелевой мембране

Хранить при комнатной температуре
Срок годности: 12 месяцев

Набор предназначен для прямого выделения высокоочищенной тотальной РНК из малых количеств различных проб, в том числе крови, животных и растительных тканей, бактерий и вирусов. Метод, основанный на спин-колонках позволяет полностью удалить ингибиторы - такие, как двухвалентные катионы и белки. Благодаря отсутствию фенола работа с набором безопасна и не образует опасных отходов. Очищенная тотальная РНК может быть использована для ряда последующих применений. Набор позволяет выделять до 10 мкг РНК на пробу.

Название Код Цена Количество
L pack PP-210L по запросу 250 preparations
S pack PP-210S по запросу 50 preparations
Sample PP-210XS по запросу 10 preparations


Документы
Datasheet


Подготовительные процедуры: Перед началом разбавьте лизирующий буфер 2-Меркаптоэтанолом и отмывочные буферы этиловым спиртом, как указано на соответствующих бутылях и в таблице ниже.

Дополнительно потребуется (не входит в набор):
  • 2-Меркаптоэтанол (2-ME)
  • Опционально: хлороформ
  • 96-99% этиловый спирт
  • 2-Пропанол (Изопропанол)
  • 96-99% этиловый спирт
  • Пробирки 1,5 мл.


Состав набора:

PP-210XS
(10 реакций)
PP-210S
(50 реакций)
PP-210L
(250 реакций)
Лизирующий буфер
Стабилен 1 месяц при комнатной температуре
5,2 мл (добавьте 52 мкл 2-ME) 26 мл (добавьте 260 мкл 2-ME) 130 мл (добавьте 1.3 мл 2-ME)
Активационный буфер 1,2 мл 6 мл 30 мл
Отмывочный буфер для крови Добавьте 6.4 мл этанола (итоговый объем 8 мл) Добавьте 32 мл этанола (итоговый объем 40 мл) Добавьте 160 мл этанола (итоговый объем 200 мл)
Первичный отмывочный буфер Добавьте 1.6 мл этанола (итоговый объем 8 мл) Добавьте 8 мл этанола (итоговый объем 40 мл) Добавьте 40 мл этанола (итоговый объем 200 мл)
Вторичный отмывочный буфер Добавьте 6.4 мл этанола (итоговый объем 8 мл) Добавьте 32 мл этанола (итоговый объем 40 мл) Добавьте 160 мл этанола (итоговый объем 200 мл)
Элюционный буфер 1 мл 5 мл 25 мл
Спин-колонки
Пробирки 2 мл.

Выделение тотальной РНК в колонках

  1. Подготовка пробы и лизирование клеток:
    1. Кровь
      • Поместите 100 мкл некоагулированной крови в микроцентрифужную пробирку
      • Добавьте 500 мкл Лизирующего буфера и перемешайте на вортексе 10 секунд
    2. Свежие образцы животной и растительной ткани
      • Соберите 20-50 мг образца свежей ткани в микроцентрифужную пробирку.
      • Добавьте 300 мкл лизирующего буфера (с добавлением 2-ME) и гомогенизируйте материал, используя подходящее устройство (пестиком, гомогенизатором и т.д.)
      • Добавьте еще 200 мкл лизирующего буфера (с добавлением 2-ME) к гомогенизированному образцу и перемешайте на вортексе 15-30 секунд (Объем образца не должен превышать 10% от объема лизирующего буфера).
      • Центрифугируйте при 10 000 g в течение 10 минут.
      • Необязательный шаг для случая, когда в супернатанте еще остаются нерастворенные остатки:
        Добавьте 500 мкл хлороформа (не включен в набор), перемешайте на вортексе 15-30 секунд, после чего центрифугируйте при 10 000 g 10 минут.
      • Перенесите супернатант (если вы использовали хлороформ - верхнюю водную фазу) в микроцентрифужную пробирку
    3. Клетки из носовых и горловых мазков
      • Добавьте 300 мкл лизирующего буфера (с добавлением 2-ME) в микроцентрифужную пробирку.
      • Проведите стерильным одноразовым ватным тампоном или щеточкой для взятия мазков (для буккального или назального эпителия и т.д.) в носу или во рту объекта
      • Отрежьте участок, на котором собраны клетки и поместите его в микроцентрифужную пробирку, содержащую лизирующий буфер
      • Закройте пробирку, перемешайте на вортексе и инкубируйте при комнатной температуре 5 минут.
    4. Клеточная культура в монослое
      • Отделите культуральную среду
      • Добавьте 500 мкл лизирующего буфера (с добавлением 2-ME) на 1-5 х 106 клеток.
      • Лизируйте клетки и гомогенизируйте образец пипетированием в течение некоторого времени
    5. Клеточная культура в суспензии
      • Осадите 1-5 х 106 животных, растительных или дрожжевых клеток или 1 х 107 бактериальных клеток. (В некоторых случаях для разрушения клеточной стенки дрожжевых и бактериальных клеток может потребоваться дополнительный ферментативный лизис или механическое воздействие)
      • Удалите супернатант и добавьте 500 мкл лизирующего буфера (с добавлением 2-ME).
      • Лизируйте образец повторяющимся пипетированием или перемешиванием на вортексе в течение 10 секунд.
  2. Активация колонки (необязательно):
    • Поместите спин-колонку в 2 мл пробирку для образцов
    • Добавьте 100 µl Активационного буфера в спин-колонку
    • Центрифугируйте при 10 000 g в течение 30 секунд
    • Удалите отфильтровавшуюся жидкость
    • Немедленно переходите к следующему шагу
  3. Загрузка колонок:
    • Добавьте 300 мкл (или 0.6 x объема клеточного лизата) Изопропанола к подготовленному лизату и перемешайте на вортексе.
    • Переместите смесь в спин-колонку
    • Центрифугируйте 30 секунд при 10 000 g
    • Удалите отфильтровавшуюся жидкость
  4. Первичная отмывка:
    • Выделение из крови
      • Добавьте в колонку 700 µl отмывочного буфера для крови
      • Центрифугируйте 30 секунд при 10 000 g и удалите отфильтровавшуюся жидкость
    • Выделение из тканей, щеток и клеточных культур
      • Добавьте в колонку 700 µl первичного отмывочного буфера
      • Центрифугируйте 30 секунд при 10 000 g и удалите отфильтровавшуюся жидкость
  5. Вторичная отмывка:
    • Добавьте в колонку 700 µl вторичного отмывочного буфера
    • Центрифугируйте 30 секунд при 10 000 g и удалите отфильтровавшуюся жидкость
    • Центрифугируйте снова 2 минуты при 10 000 g для удаления остатков этанола
  6. Элюция РНК:
    • Поместите спин-колонку в чистую, свободную от ДНКаз/РНКаз микроцентрифужную пробирку.
    • Добавьте 40-50 µl элюционного буфера в центр мембраны колонки
    • Инкубируйте 1 минуту при комнатной температуре
    • Центрифугируйте 1 минуту при 10 000 g для извлечения ДНК в раствор
    • Храните РНК при -20 или -80 °C.

Удаление остаточной ДНК

Остаточная геномная ДНК может быть особенной проблемой при последующем RT-PCR или количественном определении низкокопийных транскриптов. Для полного удаления геномной ДНК из препарата РНК рекомендуется Jena Bioscience gDNA Removal Kit (Cat.-No. PP-219). Набор основан на термолабильной двуцепочечной ДНКазе (dsDNase), необратимо инактивирующейся при умеренных температурах.

Информация представлена исключительно в ознакомительных целях и ни при каких условиях не является публичной офертой