Липофекция

ПРИНЦИП МЕТОДА

Липофекция - основанная на липидах технология трансфекции, относящаяся к биохимическим методам (включает также полимеры, декстран DEAE и фосфат кальция).

Принцип липофекции заключается в связывании нуклеиновых кислот с композицией катионных липидов. Получающиеся молекулярные комплексы, известные как lipoplexes, захватываются клетками. 

Главные преимущества липофекции - ее высокая эффективность, способность трансфецировать все типы нуклеиновых кислот в широком диапазоне типов клеток, простоте использования, воспроизводимость и низкая токсичность. Кроме того, этот метод подходит для всех приложений трансфекции (транзиентная, стабильная, котрансфекция, обратная, последовательная или многократная трансфекции …), высоко производительного скрининга и также показал хорошую эффективность в некоторых моделях in vivo.

Как это работает?

Основанные на липидах реактивы, используемые для липофекции, обычно состоят из синтетических катионных липидов, часто в виде смеси со вспомогательными липидами, такими как DOPE (1,2 диолеоил фосфатидилэтаноламин) или холестерин. Эта липидная смесь собирается в липосомы или мицеллы с суммарным положительным зарядом при физиологическом pH и в состоянии формировать комплексы (lipoplexes) с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами за счет электростатических взаимодействий. Ассоциация основанного на липиде реактива трансфекции с нуклеиновыми кислотами приводит к высокой  компактизации и защите нуклеиновых кислот; эти катионные комплексы в основном усваиваются эндоцитозом.

В клетках описано два механизма, приводящих к высвобождению нуклеиновых кислот в цитоплазму. Один основан на буферной емкости эндосом за счет поликатионных остатков - “эффект протонной губки”). Другой - способность клеточных отрицательно заряженных липидов нейтрализовать катионные остатки реактива для трансфекции, что приводит к дестабилизации эндосомальных мембран.

Наконец, клеточные и молекулярные события, которые приводят к транспорту ДНК в ядро (не требуется для миРНК) и экспрессией генов, остаются недоказанными. Однако значение клеточного деления для эффективности трансфекции говорит в пользу предположения, что разрушение ядерной мембраны во время процесса митоза приводит к захвату ДНК ядром. Тем не менее, трансфекция первичных и неделящихся клеток и применение in vivo также возможны и для липофекции, что указывает на то, что ДНК может добраться к ядру, где происходит экспрессия генов.

TEE - ТЕХНОЛОГИЯ

Катионные липиды (lipoplexes) и полимеры (polyplexes) являются наиболее используемыми невирусными системами трансгенеза. Tee-Технология (Индуцированноеое эндосомальное высвобождение) объединяет и эксплуатирует свойства обоих вариантов для достижения чрезвычайно эффективной доставки нуклеиновых кислот в клетки. Действительно, это новое поколение липополиаминов содержит липофильную часть, как и липиды, и заряженный остаток полиамина, как катионные полимеры. Эти половины действуют в синергии для обеспечения высокой компактизации нуклеиновых кислот и их защиты и очень эффективной дестабилизации эндосомальной мембраны, что дает возможность высвобождения больших количеств нуклеиновых кислот в цитозоль и захват ДНК в ядро. Особое внимание было уделено синтезу биоразлагаемых соединений. Таким образом, реактивы для трансфекции не вмешиваются в клеточные механизмы, сохраняется высокая жизнеспособность клетки в каждом эксперименте, и появляется возможность избежать любых потенциальных побочных эффектов.

КАКОВЫ ПРИЛОЖЕНИЯ

Эффективность трансфекции, объединенная с высоким уровнем экспрессии  трансгенов или высоким подавлением активности генов и минимальной цитотоксичностью, зависит от разнообразных критических параметров. Эти факторы включают тип клетки, характеристики плазмидной ДНК (размер, промотор, репортерный ген) и ее чистоту, последовательность миРНК и ее чистота, состояние клеточной культуры (среда с или без сыворотки, числа клеток, отсутствия загрязнений …), количество нуклеиновых кислот и реактивов,- вот только некоторые из них. Следовательно, реактивы трансфекции должны быть специально оптимизирован для типов нуклеиновых кислот, которые будут доставляться (ДНК, миРНК, мРНК, ODN, шРНК и т.д.) и клеток для достижения оптимальной эффективности. В этом контексте OZ Biosciences разработал несколько выдающихся реактивов трансфекции:

• DreamFect™ Gold: для всех нуклеиновых кислот, высокий уровень экспрессии трансгенов

• DreamFect™ : для всех типов нуклеиновых кислот, любых клеток, включая суспензионные линии

• Lullaby™ :  для миРНК

• VeroFect™ : для трансфекции клеток Vero

• FlyFectin™: для клеток насекомых

• EcoTransfect™ : для популярных клеточных линий и рутинной дешевой трансфекции

• COSFect : для трансфекции COS

• HeLaFect: для трансфекции HeLa

• Ab-DeliverIN™ : для внутриклеточной доставки антител

• Pro-DeliverIN™: для внутриклеточной доставки белков

Метод липофекции особенно хорош для иммортализованных клеток.

Свяжитесь с нами для списка клеток, на которых был протестирован данный метод.

Главные преимущества технологии Tee

• Компактизация ДНК в наночастицах и эффективное усвоене клетками
• Защита нуклеиновых кислот против деградации нуклеаз
• Эффективная дестабилизация мембран и доставка ДНК
• Очень эффективный даже при малых количествах нуклеиновых кислот
• Биодеградируемость

КАК ИСПОЛЬЗОВАТЬ РЕАКТИВЫ ЛИПОФЕКЦИИ?

Протокол - очень прямая и простая процедура

1. Подготовка растворов ДНК и реактива. 

2. Смешивание их вместе и инкубация 20 минут

3. Добавление к клеткам.

Технологии и методы