Мечение РНК/кРНК

Нерадиоактивное мечение ДНК и РНК

Биотин- и Диоксигенин- меченые нуклеотиды

Флуоресцентные нуклеотиды: мощный набор инструментов для мечения биологических макромолекул

РНК и кРНК фрагменты разной длины ("зонды") способны формировать нековалентные высокоспецифичные дуплексы с комплементарными нуклеотидными цепями (гибридизация). Когда метка присоединяется к такому гибридизационному зонду, она может эффективно служить для детекции определенной ДНК или РНК последовательности-мишени. Меченые РНК/кРНК зонды обычно используются, например, для (флюоресцентной) in situ гибридизации ((F)ISH - fluorescence in situ hybridization), количественного анализа экспрессии генов на микрочипах или анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA - Electrophoretic mobility shift assay).

Большинство обычно используемых меток для создания нерадиоактивных РНК/кРНК зондов - это флюорофоры, гаптены, последние представлены Биотином, Детиобиотином, Дигоксигенином и Динитрофенолом. Флюорофоры напрямую определяются с помощью флюоресцентной спектроскопии, тогда как визуализация гаптенов требует вторичных репортерных молекул (непрямых меток). Более подробная информация содержится в руководстве "Нерадиоактивное мечение ДНК и РНК".

Флюорофоры и гаптены ферментативно встроены в РНК/кРНК с помощью модифицированных нуклеотидов (см.таблицу), которые включены как заменители для их природных аналогов либо при одношаговой процедуре (введение флуоресцентного или гаптен-модифицированного нуклеотида), либо при двухшаговой процедуре (введение реакционной группы, несущей нуклеотид и последующее флуоресцентное или гаптеновое мечение).

Одноступенчатое РНК/кРНК мечение		Двухступенчатое РНК/кРНК мечение
Флуоресцентное мечение Флуоресцентные нуклеотиды Fluorescent in vitro Transcription Labeling Kits		КЛИК-мечение CLICK-функционализированные нуклеотиды CLICK T7 in vitro набор мечения при транскрипции
Гаптен- мечение Биотинилированные нуклеотиды Диоксигенин-модифицированные нуклеотиды		Амин- мечение Амин-модифицированные нуклеотиды

Стандартные ферментные процедуры обработки нерадиоактивных РНК/кРНК зондов.

Шаблон	Метод	Меченый зонд	Сайт	Фермент
ДНК	in vitro Транскрипция	кРНК	случайный	T7- / SP6- / T3-РНК полимераза
РНК	3’ концевое мечение	РНК	3’ OH	Терминальная Деоксинуклеотидил Трансфераза (TdT)
		РНК	3’ OH	Дрожжевая Поли(А) полимераза
		РНК	3’ OH	T4 РНК лигаза
	5’ концевое мечение	РНК	5’ OH	T4 полинуклеотидкиназа (T4 PNK)