Реактивы для трансфекции и трансдукции CRISPR/Cas9 для редактирования генома

“Редактирование генома” или “Разработка генома” дают возможность ввести множество генетических альтераций (делеция, инсерция …) в клетки млекопитающих. В течение прошлого десятилетия нуклеазы c "цинковыми пальцами" (ZFNs) и подобные активатору транскрипции эффекторные нуклеазы (TALENs) были предпочтительными инструментами для технологий редактирования генома до недавнего открытия технологии CRISPR/Cas9 , которая коренным образом изменила эту область исследований.

Успешное  редактирование генома CRISPR/Cas9  может быть выполнен посредством разнообразных подходов (плазмиды, мРНК, нуклеаза, вирусная доставка). Соответственно, эффективная доставка нуклеиновой кислоты (трансфекция или трансдукция) представляет собой важный шаг для экспериментов по редактированию генома. OZ Biosciences обладает более чем 10 годами опыта в развитии реактивов трансфекции и предлагает оптимизированные решения для трансфекции по технологии CRISPR/Cas9.

Реактив для трансфекции CRISP/Cas9

PolyMag Neo   Pro-DeliverIN RmesFect ViroMag

Рисунок 1. Реактивы для трансфекции, адаптированные для метода CRISP/Cas9

Для генерации клеточных моделей Cas9 и специальная sgRNA (химерная РНК, содержащая все существенные компоненты crRNA и tracRNA), могут быть введены в клетки - мишени. Системе CRISPR/Cas типа II нужен только белок Cas, который может быть экспрессирован в клетках - мишенях несколькими способами: (1) трансфекция плазмиды, (2) прямая доставка активной эндонуклеазы Cas9, (3) трансфекция мРНКа для Cas9 или (4) вирусная трансдукция.

Название продукта	Вектор	Технология	Назначение	Протокол CRISPR Cas9
PolyMag Neo	Плазмидная ДНК	Магнетофекция	Первичные и трудно трансфецируемые клетки
Pro-DeliverIN	Белок	Липофекция	Все клетки
RmesFect	мРНК	Липофекция	Все клетки
ViroMag	Вирус	Магнетофекция	Все клетки, включая первичные и трудно трансфецируемые

Редактирование геномов с помощью CRISPR/Cas9

В 2013 четыре группы продемонстрировали, что CRISPR/Cas9, связанный с направляющей РНК, может использоваться для редактирования генов [2-5]. На основе механизма типа II CRISPR/Cas9 исследователи создали однонаправленную направляющую РНК (sgRNA), который в состоянии связаться со специфической последовательностью дцДНК. Это приводит к двуцепочечными разрывами (DSB) в целевом сайте со следующей структоурой: (1) последовательность из 20 по, соответствующая протоспейсеру направляющей РНК и (2) мотив, прилежащий к протоспейсеру (PAM) из 3 по даунстрим NGG. Таким образом, редактирование генома CRISPR/Cas9 зависит от образования DSB и последующего клеточного процесса репарации ДНК. Присутствие DSB в ДНК, сгенерированных CRISPR/Cas9, приводит к активации клеточных процессов репарации ДНК, включая подверженное ошибкам негомологичное соединение концов (NHEJ), и безошибочную гомологичную репарацию (HDR). Инсерции и делеции в целевом сайте, сгенерированные NHEJ и HDR, позволяют нарушать или отменять функцию целевого гена. Кроме того, модификации в этой системе могут также использоваться для сайленсинга генов вставки новой экзогенной ДНК или блокирования транскрипции РНК.

Как работает CRISPR/Cas9?

Система CRISPR/Cas9 происходит из бактерий, у которых она обеспечивает приобретенный иммунитет против вторжения в инородной ДНК за счет ее деградации под управлением РНК  [1]. Бактерии собирают «протоспейсеры», короткие сегменты чужеродной ДНК (например, от бактериофагов) и интегрируют их в их геном. Потом последовательности геномных локусов CRISPR транскрибируются в короткие РНК CRISPR (crRNA) которые отжигаются на трансактивирующий crRNA (tracrRNAs) для разрушения любой последовательности ДНК, соответствующей протоспейсеру. После транскрипции и обработки, crRNA сначала объединяется с Cas9 и tracrRNA, а затем связывает его целевую последовательность на ДНК, затем происходит формирование R-петли и разрезание ДНК. Cas9 действует как эндонуклеаза для расщепления ДНК (рисунок 1), crRNA используется в качестве направляющего.

Рисунок 2: нуклеаза CRISPR-Cas9 программируется sgRNA. После связывания направляющей sgRNA комплекс (tracrRNA-crRNA) специально нацеливается на короткие последовательности-тэги ДНК (PAM) и расплетает  ДНК, комплементарную sgRNA. Гетеродуплекс sgRNA-ДНК индуцирует формирование R-петли и дальнейшую структурную перестройку: узнающий (REC) и нуклеазный (NUC) домены поворачиваются, чтобы полностью охватить целевую последовательность ДНК. Две области нуклеазы (RuvC, HNH) разрезают по одной нити ДНК, генерируя двухнитевой разрыв. Структурно область REC взаимодействует с sgRNA, а домен NUC обеспечивает взаимодействие с PAM и целевой ДНК, .

 Преимущества CRISPR/Cas9 перед ZFNs и TALEN

CRISPR/Cas9 может легко быть адаптирован к любой геномной последовательности путем замены 20 п.о. протоспейсера направляющей РНК; белковый компонент Cas9 остается неизменным. Эта простота использования представляет главное преимущество перед ZFNs и TALENs в генерации библиотек всего генома или мультиплексирования направляющей РНК в одни и те же клетки.

• ZFNs и TALENs основаны на управляемом белком распаде ДНК, который требует сложной белковой инженерии.
• CRISPR/Cas9 нужна только короткая направляющай РНК для нацеливания на ДНК.
• CRISPR/Cas9 делает возможным использовать несколько gRNA с различными целевыми сайтами: одновременно геномные модификации в разнообразных независимых сайтах [2].
• Ускоряет генерацию трансгенных животных с разнообразными генными мутациями [6].

Система CRISPR/Cas9 представляет гибкий и надежный инструмент редактирования генома. Компоненты CRISPR/Cas9 включают эндонуклеазу и sgRNA, которые могут быть доставлен в клетки в различной форме (т.е. плазмида, мРНК, нуклеаза, вирус)..

Ссылки

1. Wiedenheft B, et al. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 482, 331-338.
2. Cong L, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339 (6121):819-823.
3. Mali P, et al. RNA-guided genome engineering via Cas9. Science. 2013;339 (6121):823-826.
4. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337 (6096):816-821.
5. Cho SW, Kim S, Kim JM, Kim JS.  Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol. 2013;31(3):230-232.
6. Wang H, et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013;153 (4):910-8.

Технологии и методы